本文续《猪病学》第11版之“经典猪瘟”篇（上）、经典品读汇 | 《猪病学》第11版之“经典猪瘟”篇（中）之后的内容
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Peter D. Kirkland, Marie‐Frédérique Le Potier, and Deborah Finlaison（著）
李明明 郭海荣（译）
徐大为（校）
猪瘟病毒检测
根据毒株毒力、检测方法和样本，CSFV一般可在感染后24小时内检测出来(Liu et al. 2011)。病毒可以从加有肝素或EDTA的全血、血清血浆和血沉层中分离。最有可能富含CSFV的组织有扁桃体、脾脏、肾脏、回盲淋巴组织和咽喉淋巴结。
尽管病毒分离是确认病毒感染的重要参考方法，但耗时费力，不适合控制病毒进一步传播的快速反应需求。使用病毒分离的目的是分离毒株，对病毒特性进行鉴定以便于疫苗的进一步研究。CSFV可用猪肾细胞系(PK15或SK6 )进行分离，关键是所用的细胞、培养基和试剂都要确保没有瘟病毒及抗体存在。
qRT-PCR是目前较好的检测病毒RNA的方法。这些方法具有高敏感性（诊断和分析）和特异性，特别是探针法(Hoffmann et al.2005, 2011; Le Potier et al.2006)。很多CSFV特异性qRT-PCR试剂盒已经商业化。操作步骤都是特为检 C 株活病毒基因组设计的，还可以同时检测 CSFV 和 ASFV 基因组的试剂盒(Haines et al.2013)。
qRT-PCR可用于多种样品CSFV感染的检测，但主要是全血、棉拭子和组织样品。此外，血清、血浆和白细胞也可以。用于病毒分离的样品包括扁桃体、脾脏、回肠和淋巴结，但肾脏组织可能敏感性较差。
高质量的新鲜样品最好，病毒RNA可存在于灭活组织中，病毒分离可能会因组织自融等原因未分离到。例如来自野猪的样品（Petrov 等 2014）。病毒RNA可以长时间在一些组织中检测到（例如可以在至少康复9周的猪扁桃体中检测到病毒RNA）(Blome et al.2006)。
利用qRT-PCR方法扩增病毒基因组片段，可以区分CSFV、BVDV、BDV甚至CSFV不同毒株(Zhang et al.2012)。根据疫苗和被检测样品，qRT-PCR可以用DIVA方法检测（可区分野毒株和疫苗毒株）。最近研发的C株特异性qRT-PCR试剂盒可以用于检测免疫弱毒疫苗的动物，但是检测到阳性结果不能排除野毒感染的可能性。特异性区别野毒和疫苗毒的PCR方法(Liu et al.2009; Zhao et al.2008) 可以检测或排除野毒感染(Blome et al.2011)。
高度敏感的qRT-PCR可用于混合样品的检测(Depner et al.2007; Le Dimna et al.2008)，这样可以显著提高检测量。但也有其它方面的考虑，包括准备混合样品的时间，重新检测单个阳性样品所需要时间。为了避免敏感性降低，需要掌握操作方法的详细资料，并对RNA水平进行检测，在混合样品前还需要比较临床病例和免疫猪群的特点。
通常情况下，qRT-PCR检测结果为阴性通常认为未感染，但检测结果为阳性并不意味着动物感染了CSFV(Haegeman et al.2006)。
抗原捕获ELISA被用于活猪早期CSFV感染的诊断；双夹心ELISA是针对多种病毒抗原的单抗或者多抗为基础的检测方法，血清、血浆及血沉棕黄层、加入肝素或EDTA及组织匀浆都可以采用这些方法检测。这些方法操作简单，也不需要组织培养设备，操作简单，并在36小时内出结果(Depner et al.1995)，但也要认识到抗原捕获ELISA的局限性。目前所用的商业化试剂盒敏感性都比细胞VI低(Blome et al.2006)。另外，这些方法检测仔猪血清样品的敏感性要比来自成年母猪或者亚临床症状和轻微症状的猪要高(Anonymous，2002)。为了弥补检测方法敏感性的不足，所有表现异常的猪群都要检测。这些方法特异性较差，并会出现假阳性结果，因此，抗原捕获ELISA仅用于有临床症状或符合猪瘟病变和监测近期疑似感染的猪群。
尽管FAT能用于冰冻切片病毒抗原的检测，敏感性高，可批量检测，但该方法很快被qRT-PCR代替，可用于将来猪瘟爆发时的检测。
猪瘟抗体检测
病毒中和试验（VN）是检测CSFV特异性抗体的参考方法。CSFV中和抗体水平可用血清终点滴定法测定。但是VN要求高质量血清及细胞培养系统。因为VN法通常需要 3-5 天时间才能出结果，因此不适合常规大规模测定。
由于不同瘟病毒间存在抗体交叉反应，VN实验能检测动物感染的病毒类型。VN检测需要两个或多个重复，CSFV中和抗体的效价要与BVDV、BDV参考毒株的中和抗体效价进行比较，效价差别4倍或以上可以认为是最高中和抗体效价的病毒感染(Anonymous，2002)。这种方法通常用于疾病爆发猪场周围其它猪场控制措施解除前的检测。
ELISA方法可用于流行病学调查，监测无CSFV区域非常实用。竞争ELISA是建立在用抗CSFV血清与针对于CSF E2蛋白的特异性单克隆抗体基础上，利用竞争ELISA可以减少与其它瘟病毒抗体的交叉反应，常用的包被抗原是用昆虫杆状病毒表达的E2(gp55)抗原。CSFV感染后10-15天可用ELISA检测到抗体，这与中和抗体出现的时间相似。
Erns（rns应为上标）‐ELISAs被开发为用于E2亚单位疫苗接种群体的差异对照试验。近年来，其它Erns（rns应为上标）‐ELISAs已被开发用作为ELISA对照(Aebischer et al.2013)。然而在建议将其作为与新标记嵌合疫苗CP7-E2Alf的鉴别诊断的对照试验前，作为商业性ELISAs仍有改进空间(Schroeder et al.2012)。
免疫
尽管CSFV能引起免疫抑制，但猪只感染恢复后能产生中和抗体。中和抗体由囊膜糖蛋白E2产生，囊膜蛋白Erns （rns应为上标）和非结构蛋白N能诱导非中和抗体的产生。在感染病毒后10-20天，中和抗体可以清除病毒。
CSFV特异性中和抗体和特异性杀伤细胞是重要的免疫应答反应(Renson et al.2014)。细胞免疫和中和抗体的双组合可以提供快速、完全的保护，将病毒清除。但是每一种免疫反应均具有避免CSFV引起的致命感染的效果。E2亚单位疫苗能诱导高水平的中和抗体保护猪只(Bouma et al.1999)，也能保护相关瘟病毒或嵌合病毒的实验室感染，但未检测到针对这些病毒的中和抗体(Reimann et al. 2004; Voigt et al.2007)。
已免疫或者感染过的猪对病毒的再次感染有一定的抵抗力。CSFV是相对稳定的RNA病毒，并且在不同毒株间甚至BVDV和CSFV间都存在交叉保护(Leforban et al.1992) 。仔猪的母源抗体保护力能持续8-12周，这主要取决于初乳中的中和抗体水平(Kaden and Lange，2004)，但同时也能干扰疫苗免疫反应(Vandeputte et al.2001)。
预防和控制
猪瘟是一种全球性流行疫病，尽管一些地区已经根除，但在根除和流行区域的边界及一些野猪群中仍然存在(Laddomada，2000)。根除区域再次感染CSFV的风险依旧很高，根除地区的生产者和兽医在检测CSFV的爆发中发挥了重要作用，但是早期检测需要预警和对临床症状等进行培训。
为了满足国际贸易需求，无CSFV地区采取不免疫政策，即通过销毁被感染或者可疑猪群及实施检测来控制猪瘟(Anonymous，2001)。欧洲在根除猪瘟后也重申不免疫，这种做法尤其适合养猪密度高的地区。因为这些地区存在很多增加该病传播风险的因素(Koenen et al.1996; Mintiens et al. 2003)。在某些情况下，像1997年荷兰爆发猪瘟，限制屠宰猪只转移，避免了大量动物被安乐死。疫苗接种区至少一年禁止国际贸易，因此疫苗的使用影响了经济效益，但是面对猪瘟爆发，将来还是要考虑疫苗紧急接种。
目前有很多可供选择使用的猪瘟疫苗，包括著名的中国C株、Thiverval株，新型能用于区分野毒和疫苗毒的标记疫苗(Blome et al.2017)。传统的活疫苗能够产生高水平的保护力，并在免疫2周后产生中和抗体(Dahle and Liess，1995)。免疫间隔达6-10个月，免疫途径（肌肉或口服）影响不大(Kaden and Lange，2001; Kaden et al.2008)。弱毒活疫苗最大的缺点是不能与野毒感染所产生的抗体进行区分。
商品化的重组E2亚单位疫苗提供了一种区分疫苗免疫动物的方法。已经进行了E2标记疫苗的免疫攻毒和传播实验的效果评估，但效果不一。单次免疫3周后接种CSFV能防止临床症状的发生并降低死亡率(Bouma et al.1999)，免疫后至少需要2周时间才能提供临床保护(Bouma et al.2000; Uttenthal et al.2001)。免疫后攻毒过早，疫苗不能提供临床保护，也不能减少病毒的携带量(Uttenthal et al.2001)。
E2标记疫苗的效果评估显示，即使免疫2次，在第二次免疫后14天用CSFV攻毒，病毒仍可通过胎盘屏障，通过2次疫苗免疫能防止妊娠母猪出现临床症状，但不能阻止CSFV的水平和垂直传播(Dewulf et al.2001b)。因此，在多数紧急免疫时，免疫动物不能阻止CSFV通过胎盘感染，疫苗不能控制“带毒母猪综合征”，最终导致猪瘟的迟发性感染。
目前，构建以遗传工程为基础的CSF疫苗研发为主要方向，有5个策略：CSFV免疫多肽、DNA疫苗、表达CSFV蛋白的病毒载体疫苗、嵌合瘟病毒和反向转录缺失CSF基因（复制子）(Blome et al. 2017)。嵌合性瘟病毒CP7-E2Alf在被广泛评估其安全性和效力后获得许可(Gabriel et al.2012)。无论何种途径接种(口服还是肌肉注射)，它都能诱导产生良好的免疫保护，防止病毒进一步传播，在育肥猪和妊娠母猪中也很安全。母源抗体(Eble et al.2014)或BVDV-1抗体(Drager et al.2016)似乎不会显著干扰疫苗的效果。该疫苗可用于紧急接种，以控制猪瘟在家猪或野猪中的传播。如果有一个完全有效的配套工具包，其DIVA疫苗是一个非常有价值的工具，控制疫情，同时进行血清学监测。
野猪猪瘟
野猪是CSFV的潜在宿主，大部分家猪爆发猪瘟可归结于野猪的传播(52%，Fritzemeier et al. 2000)。因此，自上世纪90年代以来，为限制CSFV在野猪群中的广泛传播，欧盟成功地实施了大规模口服野猪疫苗(Rossi et al.2015)。CSFV感染对野猪似乎是无害的，因为在过去的爆发中很少有死亡报告。在自然或人为屏障存在的情况下，野猪种群中的CSFV可以被限制在一个特定的区域内，直到最终被消除(Pol et al.2008)。
控制野猪CSFV的经典措施包括减少狩猎，使病毒在易感群体中传播，并导致死亡或免疫，然后对最易感动物(幼猪和幼母猪)进行有针对性的狩猎。在一些难以用标准方法根除CSFV的地区，已经尝试使用混合在口服诱饵中的C株口服活疫苗接种(Kaden等，2000)。该疫苗的安全性已在其它野生动物中得到证实(Chenut et al.1999)。
口服疫苗可在10天内诱导猪只产生较强的保护性免疫(Kaden and Lange，2001)。然而最近对口服疫苗野外接种数据分析表明，需3倍剂量的口服疫苗才能对野猪提供足够的保护力。大多数研究表明，由于难以获得诱饵，幼龄猪没有获得足够的保护性免疫(Kaden et al.2002)。如果将疫苗用于预防，并在病毒进入该地区前至少一年进行接种，则疫苗接种似乎更有效，从而为实现高水平的群体免疫提供了时间。为预防疾病的传播，建议在疫情爆发前进行常规疫苗接种(Rossi等，2010年)。
使用疫苗后，能区分野毒和疫苗免疫野猪的唯一方法是通过DIVA qRT‐PCR检测 (Leifer等，2009)。因此，很难决策何时停止接种疫苗。CSFV抗体可持续多年，并在大规模口服疫苗免疫后进行监测。因此，建议加强阳性监测，以便发现病死野猪。然而，由于在自然界中很少发现尸体，因此建议结合对幼畜的血清学监测和数据建模，以确定幼畜血清价超过5%为预警点。在这些地域，应实施有针对性的血清学和病毒学监测(Saubusse et al.2016)。在未来，口服DIVA疫苗是很有价值的，通过血清学监测及时发现野毒的传播。嵌合性瘟病毒CP7-E2alf是目前最有希望用于口服的候选活疫苗。
注：版权归《猪病学》第11版原创作者所有；未完待续！敬请关注！
