对于活疫苗来说，疫苗的病毒滴度与免疫保护率一般在一定范围内呈正相关，即免疫的病毒含量越高，保护率就越高，反之就越低。相比鸡胚成纤维细胞生产的伪狂犬病活疫苗，利用猪睾丸（ST）传代细胞生产的ST猪伪狂犬病活疫苗可获得更高的病毒滴度，质量稳定，更利于伪狂犬病的控制。本研究采用3批ST猪伪狂犬病活疫苗以不同的免疫剂量分别对仔猪进行免疫攻毒，测定其最小免疫剂量，为疫苗效力标准的制定提供依据。
1 材料
1.1 试验用疫苗 ST猪伪狂犬病活疫苗3批，由广东永顺生物制药股份有限公司生产，经检验全部合格。
1.2 试验用猪 20~25日龄健康仔猪，来源于广东永顺生物制药股份有限公司实验动物场自繁自养，PRV、CSFV、PRRSV、PCV2及PPV抗原阴性，未接种过PRV疫苗且伪狂犬病病毒抗体阴性。
1.3 攻毒用强毒 伪狂犬病强毒GD1株，由广东永顺生物制药股份有限公司分离、鉴定和保存。
1.4 检测试剂盒 猪伪狂犬病病毒gB抗体ELISA检测试剂盒和猪伪狂犬病病毒gE抗体ELISA检测试剂盒均购自IDEXX公司。
2 方法
2.1 病毒含量测定
按疫苗瓶签注明头份，用无血清MEM细胞培养液作10倍系列稀释，取10-4~10-74个稀释度，分别按100μl/孔接种48孔ST细胞培养板，补充维持液900μl/孔，使之总量为1000μl/孔，每个稀释度6孔，并设正常细胞对照，每天观察记录各个稀释度的细胞病变（CPE）产生情况，根据Reed-Muench法计算TCID50。
2.2 免疫攻毒试验
将55头健康仔猪随机分成11组，其中9组为免疫组，每组5头共45头，另设攻毒对照组5头和阴性对照组5头。根据病毒含量测定结果，将3批疫苗分别稀释成103.0TCID50/mL、102.0TCID50/mL、10TCID50/mL，每批疫苗各个稀释度分别肌肉注射仔猪5头，每头1.0mL。10日后连同条件相同的攻毒对照组仔猪5头，每头肌肉注射伪狂犬病病毒GD1株1.0mL，观察临床表现14日（体温、呼吸症状、食欲、生长状态和神经症状等），统计分析攻毒结果。
2.3 ELISA抗体检测
各试验组分别于免疫前和攻毒前采集血样并分离血清，按PRV gB和g E抗体检测试剂盒说明检测针对PRV的特异性gB和gE抗体变化。
3 结果
3.1 病毒含量测定结果
3个批次疫苗病毒含量分别为106.6TCID50/头份、106.4TCID50/头份和106.6TCID50/头份。
3.2 免疫攻毒试验结果
试验猪接种疫苗后无过敏反应，且接种部位无红肿发炎症状。攻毒后10TCID50/头组和102.0TCID50/头组有部分试验猪出现精神沉郁、减食和不同程度的神经症状，保护率为20%~80%（1/5~4/5），其中疫苗II的10TCID50/头组有1头试验猪在攻毒后9d死亡；103.0TCID50/头组试验猪无任何异常临床表现，保护率为100%（5/5）；攻毒对照组试验猪均在攻毒3d后体温升高至40.5℃以上，表现为精神沉郁、食欲废绝和典型的伪狂犬病神经症状，大多是后肢无法站立麻痹，或者是一侧倒地，四肢划水状，在攻毒6~8d死亡4头，发病率100%（5/5），死亡率80%（4/5）。死亡猪剖检可见肝脏有淤血，肾脏有点状出血，肺脏出现气肿和不同程度的出血坏死。具体结果见表1。
3.3 ELISA抗体检测结果
PRV-gB抗体检测结果显示，免疫仔猪的免疫前抗体均为阴性，攻毒前（免后10日）均转为阳性；攻毒对照组仔猪的免疫前和攻毒前PRV-gB抗体均为阴性。所有试验仔猪在免疫前和攻毒前PRV-gE抗体均为阴性。
4 讨论
目前猪伪狂犬病防疫使用最为普遍的是基因缺失疫苗，ST猪伪狂犬病活疫苗选用的Bartha-K61株为gE自然基因缺失，能够有效抵抗PRV强毒的攻击，安全且毒力不返强。自然基因缺失疫苗的优势是可以用伪狂犬病病毒抗体鉴别诊断试剂盒，准确区分野毒株抗体与疫苗激活的抗体，有良好的免疫原性和鉴别标记特性，广泛受到养殖户的欢迎，是许多国家用于猪伪狂犬病净化计划的主要疫苗。
本研究结果表明，102.0TCID50/头组虽然无仔猪死亡，但攻毒后有部分猪出现精神沉郁、减食和不同程度的神经症状，显示出PRV感染的临床症状，说明以102.0TCID50/头的剂量在免疫后10 d依然无法提供完全的免疫保护。而以103.0TCID50/头的剂量免疫ST猪伪狂犬病活疫苗能够保护仔猪抵抗PRV强毒的攻击，由此确定猪伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株，传代细胞源）最小免疫剂量为103.0TCID50/头。
在实验室条件下，伪狂犬病病毒抗体阴性的健康猪，每头注射ST猪伪狂犬病活疫苗病毒含量为103.0TCID50即可获得免疫保护。但是，在猪场实际使用中会遇到母源抗体干扰，而且目前猪场疫病复杂，所以，要取得理想的免疫效果，就必须提高疫苗病毒含量2个滴度以上。
研究表明在一定的范围内，随着免疫剂量的提高，免疫猪的抗体产生时间越早，攻毒后的临床症状和病理变化越轻，疫苗的免疫保护效力与免疫剂量呈正相关。从本试验结果可以看出，随着疫苗病毒滴度的上升，免疫保护效力也随之上升，这就为病毒滴度测定替代动物效力检验提供了依据，为疫苗大规模生产检验提供了方便，有利于疫苗的推广应用。我国伪狂犬病活疫苗质量标准要求每头份病毒含量至少5000TCID50，而进口公司大部分疫苗抗原滴度在105.0TCID50/头份以上，而3批ST猪伪狂犬病活疫苗的每头份病毒含量均在106.4TCID50以上，远高于其他猪伪狂犬病活疫苗，接种一次可以维持较长时间的免疫保护。
